附件：流行性感冒病毒抗原檢測試劑注冊申報資料指導原則（食藥監(jiān)辦械函[2011]540號）.doc

流行性感冒病毒抗原檢測試劑注冊申報資料指導原則

一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對流行性感冒病毒（以下簡稱流感病毒）抗原檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對流感病毒抗原檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

二、適用范圍

流感病毒抗原檢測試劑是指利用膠體金法、酶聯(lián)免疫法等基于抗原抗體反應原理，以特定的流感病毒抗原為檢測目標，直接對人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物樣本中的流感病毒進行體外定性檢測的試劑。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。

三、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型極少引起流行。依據(jù)病毒顆粒外膜血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分為16個H亞型（H1-H16）和9個N亞型（N1-N9）。在甲型流感病毒中，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亞型有人感染的報道。由于編碼HA和（或）NA的核苷酸序列容易發(fā)生突變，致使HA和（或）NA的抗原表位發(fā)生改變，這種抗原性的轉(zhuǎn)變使人群原有的特異性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起較大規(guī)模甚至世界性的流感流行。按照流行特點，造成人間流感流行的流感病毒可區(qū)分為季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒。季節(jié)性流感病毒通常在年度間發(fā)生小范圍的基因變異，這種基因變異會導致微小的抗原性改變，稱為抗原漂移（antigenic drift）。因此，季節(jié)性流感病毒雖具有年度特異性且抗原性的改變使感染者不易獲得持久免疫力，但傳播范圍通常局限于較小的人群范圍，一般不會造成太高的發(fā)病率和死亡率，易感人群多為老年人（>65歲）和嬰幼兒（<6歲）。在過去的幾十年中，季節(jié)性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亞型。近年來，新型甲型流感病毒亞型暴發(fā)流行的案例時有發(fā)生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行，人感染高致病性禽流感（H5亞型）病毒的病例時有報道，禽類甲型H5N1亞型流感病毒被認為具有造成人間大范圍流感流行的潛力。新型甲型流感病毒通常由于基因的節(jié)段性重組所致，這種大范圍的基因改變易導致病毒抗原特性的重大改變，稱為抗原轉(zhuǎn)變（antigenic shift）。新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同時包含了禽流感、豬流感和人季節(jié)性流感的基因片段從而導致病毒在抗原水平發(fā)生了明顯改變。由于抗原性的明顯改變以及可能由此造成的病毒毒力的增強，病毒的傳染性和致病嚴重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的發(fā)病率和死亡率。

流感病毒主要經(jīng)空氣飛沫傳播，常引起發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛以及輕到中度的呼吸道癥狀，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒抗原檢測試劑可用于流感的輔助診斷，甲型流感病毒各亞型的抗原類檢測試劑還可用于區(qū)分季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可獲得關于流感暴發(fā)的流行病學信息。

在注冊申報資料中，流感病毒的命名應采用世界衛(wèi)生組織關于流感病毒毒株命名的相關要求進行。流感病毒毒株命名包括6個要素：型別/宿主/分離地區(qū)/毒株序號/分離年份（Hn和Nn），H和N分別代表血凝素和神經(jīng)氨酸酶，n是阿拉伯數(shù)字，對于人流感病毒可以省略宿主信息。如名為“A/Shanghai/37T/2009（H1N1）”的病毒株代表2009年在上海分離的以人為宿主的H1N1亞型流感病毒，毒株序號為37T。

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應著重從方法學及不同類型毒株檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預期用途、標本采集及處理、實驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨注明文獻的相關信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對流感病毒抗原檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）試劑盒用于體外定性檢測人鼻咽拭子、口咽拭子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其他呼吸道分泌物樣本的流感病毒抗原（如核蛋白抗原），適用樣本類型應結(jié)合實際的臨床研究完成情況進行確認。

（2）簡單介紹待測目標的特征，如病毒生物學性狀、感染后的臨床表現(xiàn)、亞型、變異特征等。

（3）待測人群特征介紹：如具有流感樣癥狀的患者、相關的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等。

2.【主要組成成份】

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有人源組分，應提供其生物學來源、滅活方法及無傳染性確認的方法等。

（2）建議對用于單克隆或多克隆抗體研發(fā)的流感病毒株的信息進行簡單介紹。

（3）試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

3.【儲存條件及有效期】

對試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等信息做詳細介紹。

膠體金試紙條產(chǎn)品應對開封后未使用產(chǎn)品允許暴露于空氣中的溫度、濕度及期限等條件予以明確。

4.【樣本要求】 重點明確以下內(nèi)容：

（1）樣本采集時間點的選擇：是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）對采樣拭子及樣本保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器、轉(zhuǎn)運保存液的要求、轉(zhuǎn)運條件等。

（3）樣本采集：樣本類型、具體采集部位，醫(yī)護人員防護等信息；詳述具體的操作方法或列出相關操作指南文件（最好能夠給出具體圖示）以指導使用者，盡量減少由于樣本采集或處理不當對實驗結(jié)果造成的影響。

（4）樣本處理及保存：保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復室溫，凍融次數(shù)。

5.【檢驗方法】 詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

（1）實驗環(huán)境：溫、濕度條件，檢測試劑及樣本復溫等要求。

（2）試劑配制方法、注意事項，試劑條（卡）開封后注意事項等。

（3）試劑條和試劑卡的加樣方法如有差異，建議分別以圖示方式描述清楚。

6.【檢驗結(jié)果的解釋】

應以圖示方法給出陰性、陽性及無效結(jié)果的判讀示例。

7.【檢驗方法局限性】至少應包括以下內(nèi)容：

（1）本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床醫(yī)生參考，不得作為臨床診治的唯一依據(jù)，對患者的臨床管理應結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

（2）受抗原類檢測試劑方法學的限制，其最低檢測限（分析靈敏度）普遍較核酸類試劑低，故實驗人員應對陰性結(jié)果給予更多的關注，需結(jié)合其他檢測結(jié)果綜合判斷，建議對有疑問的陰性結(jié)果采用核酸檢測或病毒分離培養(yǎng)鑒定方法進行復核。

（3）如果申報試劑用于甲型流感病毒的檢測，應對陽性實驗結(jié)果做以下建議：建議進一步實驗以確認甲型流感病毒的亞型，并向當?shù)毓残l(wèi)生預防機構(gòu)咨詢協(xié)商處理。

（4）有關假陰性結(jié)果的可能性分析

①不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導致假陰性結(jié)果。

②病毒基因變異可能導致抗原決定簇的改變，從而造成假陰性結(jié)果，使用單克隆抗體的試劑更易發(fā)生此類情況。

③對于突發(fā)的新型甲型流感病毒，其檢測的最適樣本類型以及感染后的最佳采樣時間（病毒滴度峰值）可能尚未確認，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會降低假陰性結(jié)果的可能。

④未經(jīng)驗證的其他干擾因素，如……等可能會導致假陰性結(jié)果（如有）。

8.【產(chǎn)品性能指標】 詳述以下性能指標：

（1）對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。

（2）對于甲型流感病毒抗原（通用型）檢測試劑，應首先說明有關其性能指標確定的病毒亞型基礎以及有關新型甲型流感病毒的警示，如：以下性能指標基于季節(jié)性A/H1和A/H3亞型確認，當其他新型甲型流感病毒出現(xiàn)時，其相關的性能指標可能有所改變。

（3）甲型流感病毒抗原（通用型）各亞型驗證：用于甲型流感病毒（通用型）抗原的檢測試劑，應在此列出所有驗證過的各亞型病毒株的信息。

（4）最低檢測限（分析靈敏度）：說明試劑的最低檢出濃度，建議采用生物學方式表示病毒滴度，如半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）或空斑形成單位（PFU）的形式，簡單介紹最低檢測限的確定方法以及對最低檢測限驗證所采用的病毒株信息。

（5）企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，簡單介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品組成、來源以及濃度梯度設置等信息。

（6）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準。

（7）分析特異性

①用于甲型流感病毒各亞型（HA和/或NA抗原）檢測的試劑盒，應對除待測亞型外的其他常見亞型進行交叉反應的驗證并說明詳細情況。

②交叉反應：易產(chǎn)生交叉反應的除待測抗原外的其他病原體的驗證情況。

③干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血液、粘蛋白、膿液等。

④藥物影響：治療感冒或其他呼吸道癥狀患者外用或內(nèi)服的常見藥物對檢測結(jié)果的影響，如常見抗感冒藥物、糖皮質(zhì)激素、抗生素、中藥等，如未進行相關研究也應提供相關警示說明。

（8）鉤狀（HOOK）效應：出現(xiàn)鉤狀效應時的流感病毒抗原最低濃度或經(jīng)驗證的未出現(xiàn)鉤狀效應的最高濃度值。

（9）對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

9.【注意事項】應至少包括以下內(nèi)容：

（1）與成人相比，兒童更容易在較大范圍內(nèi)傳播病毒，且持續(xù)時間更長，因此，對兒童檢測的敏感性可能高于成人。

（2）對于甲型流感病毒或各亞型的檢測試劑，當所用抗體為單克隆性質(zhì)時，則由于核苷酸序列小范圍突變導致的抗原表位的微小變化可能會導致假陰性結(jié)果或試劑的分析靈敏度降低。

（3）有關人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）或其他組分含有人源物質(zhì)，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組份作為潛在傳染源對待。

（4）有關實驗操作、樣本保存及處理、新型甲型流感病毒驗證等其他注意事項。

（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說明

擬定產(chǎn)品標準應符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》的相關規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項中引出該附錄內(nèi)容。

流感病毒抗原檢測試劑的注冊檢測應主要包括以下性能指標：物理性狀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。陽性參考品主要考察對不同來源的病毒株、不同滴度情況下的檢測符合性，對于甲型流感病毒抗原通用型檢測試劑，在此還應考慮不同亞型的檢測能力。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反應）的驗證，應主要包括易發(fā)生交叉反應的其他病原體的假陽性情況的考核。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應該在國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家參考品的流感病毒項目，在注冊檢測時應采用相應的國家參考品進行,對于目前尚無國家參考品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應建立自己的質(zhì)控體系并提供相應的內(nèi)部參考品。

（五）主要原材料研究資料

1.試劑盒所用抗體的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細試驗資料。如抗體為申請人自制，則應詳述抗體的名稱及生物學來源（免疫刺激毒株信息），申請人對該抗體技術指標的要求（如外觀、純度、蛋白濃度、效價等），確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)；如抗體為申請人外購，則應詳述抗體的名稱及生物學來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗體性能指標及檢驗證書，詳述申請人對該抗體技術指標的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)。

2.其他主要原輔料的選擇及驗證資料，如包被板、硝酸纖維素膜、反應緩沖液等，該類原輔料一般均為外購，應詳述每一原輔料的外購方名稱，提交外購方出具的每一原輔料性能指標及檢驗證書，詳述申請人對每一原輔料技術指標的要求以及申請人確定該原輔料作為主要原輔料的依據(jù)。

3.企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應原理介紹。

3.抗體包被工藝研究，申請人應考慮如包被液量、濃度、時間等指標對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述指標的最佳組合。

4.實驗體系反應條件確定：申請人應考慮反應時間、反應溫度、洗滌次數(shù)等條件對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。

5.體系中樣品加樣方式及加樣量確定：申請人應考慮樣品加樣方式、加樣量對產(chǎn)品檢測結(jié)果的影響，通過實驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，申請人還應對可用于樣本稀釋的物質(zhì)或處理方法進行研究，通過試驗確定最終選擇的用于樣本稀釋的物質(zhì)或處理方法。

（七）分析性能評估資料

企業(yè)應提交原廠在產(chǎn)品研制階段對試盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標準、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。對于流感病毒抗原類定性檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.甲型流感病毒不同亞型的差異考慮

目前，絕大多數(shù)已獲上市批準的甲型流感病毒抗原類檢測產(chǎn)品均是以核蛋白（nucleoprotein antigen，NP）為檢測靶點，理論而言，這些試劑對所有HA和/或NA亞型應具有相同的檢測性能。然而，由于不同的病毒株在組織親和力、繁殖代謝特征、人群選擇性、時間地域特征以及檢測試劑的抗體特異性等方面具有較大差異，故甲型流感病毒抗原檢測試劑對不同的甲型亞型病毒或同一亞型的具有明顯時間、地域差異性的不同病毒株在檢測性能方面亦具有一定差異。甲型流感病毒抗原檢測試劑在進行分析性能研究時應考慮到不同病毒株的這種特性，分別選擇多個亞型的代表性病毒株進行性能驗證，并在產(chǎn)品說明書中對已予以驗證的亞型或病毒株進行說明。

2.最低檢測限（分析靈敏度）

（1）最低檢測限的確定

建議使用培養(yǎng)后病毒原液的梯度稀釋液進行最低檢測限確定，每個梯度的病毒稀釋液重復3～5份，每份稀釋液重復檢測不少于20次，將具有90%～95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限。通過另制備至少5份最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對90%～95%的檢出率進行確認。建議采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50）或空斑形成單位（plaque forming units，PFU）法進行病毒滴度的滴定，并采用上述兩種方式作為病毒濃度的表示方式。在進行最低檢測限的確認時，參與研究的甲型流感病毒的每個亞型和乙型流感病毒應至少包括不同來源的兩個具有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。

（2）最低檢測限的驗證

申報試劑應在最低檢測限或接近最低檢限的病毒濃度對每種常見待測流感病毒亞型具有時間和區(qū)域多樣性的至少3個病毒株進行驗證。對此，企業(yè)應能夠提供用于最低檢測限驗證的各個病毒株的來源、型別確認及滴度確認試驗等信息。用于最低檢測限確定和驗證的病毒株如包括疫苗株，則其應能體現(xiàn)最近流感發(fā)病季的病毒特點。

3.分析特異性

（1）交叉反應

①用于流感病毒抗原檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：抗原結(jié)構(gòu)的同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。

②建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。申請人應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

③首先，應在流感病毒不同型別和亞型間進行交叉反應驗證；其次，采用其他的病原微生物進行驗證（見表1）。

④申請人應提交所有用于交叉反應驗證的病原體來源、種屬/型別和濃度確認等信息。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

表1　建議用于交叉反應性研究的微生物

*項：選擇性驗證。

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：血液、鼻分泌物或粘液、用于緩解鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和過敏癥狀的藥物（見表2）。

②使用醫(yī)學相關水平的干擾物濃度進行驗證，建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度("最差條件")條件下進行評價。

③申請人應采用每種流感病毒亞型的至少兩種病毒株對呼吸道樣本中物質(zhì)的潛在抑制影響進行評估，建議在每種流感病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。

表2　建議用于干擾研究的物質(zhì)

4.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考相關的美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）-EP文件或國內(nèi)有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等，針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑本身外，還應對操作者、實驗地點等要素進行相關的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應至少包括3個水平:

①陰性質(zhì)控品：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應高于95%（n≥20）。

③陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%，且CV≤10%（n≥20）。

另外，建議選擇適量臨床采集的新鮮病人樣本（包括所有樣本類型）作為無靶值質(zhì)控品進行精密度評價，以更好地模仿臨床檢測環(huán)境。

5.陽性/陰性參考品

如申報產(chǎn)品有相應的國家參考品，則企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品應參考國家參考品的項目設置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結(jié)合實際情況設置合理的內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設定企業(yè)內(nèi)部參考品，陽性參考品應著重考慮病毒型別、亞型及滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應）的驗證情況。

申請人應對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的實驗驗證，并提交詳細的驗證資料。

6.鉤狀（HOOK）效應

目前，流行性感冒病毒抗原檢測試劑大多采用夾心法的原理檢測樣本，考慮到方法學的缺陷，有必要對鉤狀效應進行考慮。建議采用高濃度的流感病毒抗原參考品進行梯度稀釋后由低濃度至高濃度開始檢測，每個梯度的病毒稀釋液重復3～5份，將顯色深度隨濃度升高反而變淺時的濃度作為出現(xiàn)鉤狀效應時流感病毒抗原的最低濃度，建議產(chǎn)品說明書上明示包被的抗體濃度和出現(xiàn)鉤狀效應時流感病毒抗原的最低濃度。

（八）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及開瓶穩(wěn)定性（如涉及）等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少3批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到低溫條件下長時間保存可能造成病毒抗原性丟失或減弱，申請人應對樣本穩(wěn)定性進行合理的驗證，主要是對冷藏和冷凍兩種條件下的有效期進行驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇3～5個溫度點（應至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。在對樣本進行效期穩(wěn)定性的評價時，同時應對推薦使用的采樣拭子、樣本保存液及保存容器進行合理驗證。需要冷凍保存的樣本應對凍融次數(shù)進行合理的驗證。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（九）臨床試驗資料

1. 研究方法

對于已有同類產(chǎn)品上市的試劑的臨床研究，選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品或臨床預期用途相似的流感病毒核酸檢測試劑作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。另外，申請人還應選擇一定數(shù)量的新鮮采集樣本進行考核試劑與流感病毒檢測的“金標準”方法—病毒分離培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，每種樣本類型不少于30例經(jīng)病毒分離培養(yǎng)方法確定為陽性的樣本。

另外，對于已獲上市批準的甲型流感病毒抗原（通用型）檢測試劑，如果在其注冊證有效期內(nèi)出現(xiàn)了新型甲型流感病毒的暴發(fā)流行，如有需要，生產(chǎn)企業(yè)應迅速針對新的流感亞型開展臨床比對研究，可以采用病毒檢測的“金標準”方法或當時衛(wèi)生部門認可的針對該新型甲型流感病毒亞型的診斷標準作為參比方法進行臨床比對研究，分別對采集自新型甲型流感病毒感染（陽性病例不少于30例）、其他常見的流感病毒亞型（如當年流行的季節(jié)性甲型流感病毒）以及非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者的新鮮樣本進行比對實驗研究，總例數(shù)不少于100例，如臨床試驗研究結(jié)果可以證明其對新型甲型流感病毒亞型的檢測能力，申請人在重新注冊時應考慮到因病毒株變化而導致預期用途發(fā)生實際改變的因素，同時提出變更申請，并按相關法規(guī)要求提交分析性能評估和臨床試驗研究等資料。

2.臨床研究單位的選擇

考慮到流感病毒不同病毒株的區(qū)域性特征較強，故建議申請人在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究單位應具有呼吸道疾患診療、病毒分離培養(yǎng)鑒定方法或分子生物學方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機型應完全一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，考核試劑的樣本類型不應超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應采用病毒分離培養(yǎng)鑒定或其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應選擇具有流感癥狀/體征(例如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發(fā)燒、頭疼、肌痛)、流感相似癥狀或有密切接觸史的人群作為研究對象。患者流感癥狀出現(xiàn)后，流感病毒在鼻腔或氣管分泌物中的濃度在24～48小時內(nèi)將保持較高水平，但在不同年齡段人群可能有一定差異，在兒童體內(nèi)的持續(xù)時間更長。企業(yè)在建立病例納入標準時，應考慮到各年齡段人群的差異，盡量覆蓋各個年齡段人群。在進行結(jié)果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的要求外，建議對各年齡段人群分層進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

對于新型甲型流感病毒亞型抗原（Hn或Nn抗原）檢測試劑，如新型甲型流感病毒（2009流行株）、高致病性禽流感病毒H5亞型等，其臨床研究所選擇病例除新型甲型流感病毒感染者及密切接觸者外，還應包括其他當年流行的季節(jié)性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者等。其臨床研究應能夠體現(xiàn)該產(chǎn)品對新型甲型流感病毒抗原檢測的特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應為實際臨床檢測中常用的樣本類型。通常，我們建議對于每種樣本類型應有不少于100例的陽性病例，對于陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計學分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床研究方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應采用“金標準”方法或臨床上普遍認為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進行復核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。

7. 臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數(shù)及標準。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。

（2）具體的臨床試驗情況

①申報試劑和參比試劑的名稱、批號、有效期等信息。

②對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗人員培訓、質(zhì)控品檢測情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

④具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

（3）統(tǒng)計學分析

①數(shù)據(jù)預處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②定性結(jié)果的一致性分析

陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

（4）討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

四、名詞解釋

1.分析特異性（analytical Specificity）：測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學相關濃度值水平的分析干擾程度。

注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物。

2.精密度（precision）：在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

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