北京市藥品監(jiān)督管理局關于印發(fā)《北京市醫(yī)療器械無菌檢驗檢查要點指南（2023版）》的通知

發(fā)布時間：2023年12月08日

京藥監(jiān)發(fā)〔2023〕277號

各區(qū)市場監(jiān)管局，房山區(qū)燕山市場監(jiān)管分局，市市場監(jiān)管局機場分局，北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)管理委員會商務金融局，市藥監(jiān)局各分局，各相關事業(yè)單位：

為深入貫徹落實醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管相關法規(guī)要求，進一步規(guī)范北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查工作，持續(xù)強化醫(yī)療器械生產(chǎn)科學監(jiān)管，市藥監(jiān)局組織對《醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）》進行了修訂，形成《北京市醫(yī)療器械無菌檢驗檢查要點指南（2023版）》，現(xiàn)印發(fā)給你們，請參照執(zhí)行。

特此通知。

北京市藥品監(jiān)督管理局

2023年12月6日

附件：北京市醫(yī)療器械無菌檢驗檢查要點指南（2023版）

北京市醫(yī)療器械無菌檢驗檢查
要點指南（2023版）

無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項重要內(nèi)容。其檢驗方法、檢驗結果判定及檢驗人員業(yè)務能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完成。

本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強對無菌檢驗重要性的認識、加強對無菌檢驗相關知識的掌握，指導和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗過程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時，為醫(yī)療器械注冊人、備案人、受托生產(chǎn)企業(yè)（以下簡稱“生產(chǎn)企業(yè)”）在無菌檢驗的過程管理要求提供參考和依據(jù)。

本指南中涉及或引用的國家相關法律、法規(guī)、規(guī)章、標準、檢查指南等發(fā)生內(nèi)容或效力變化時，要以當時執(zhí)行的最新版為準。必要時，北京市藥品監(jiān)督管理局應重新研究修訂，以確保本指南持續(xù)符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實施醫(yī)療器械注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等涉及無菌檢驗檢查的參考資料。

二、檢查內(nèi)容

檢查人員應在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗活動的情況下，對其無菌檢驗過程的控制情況進行全面的檢查并對其控制水平作出客觀的評價。

一般情況下，檢查人員可按照以下順序開展檢查工作，并適時做好相關記錄：

1．了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無菌檢驗方法。常見的產(chǎn)品無菌檢驗方法包括直接接種法和薄膜過濾法。當建立產(chǎn)品的無菌檢驗方法時，生產(chǎn)企業(yè)應進行方法適用性試驗，以證明所采用的方法能夠給出正確的結果。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。方法適用性試驗應按供試品無菌檢驗的規(guī)定及有關要求進行操作，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性和對微生物無毒性。應對藥典規(guī)定的每一試驗菌逐一進行方法確認。方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢驗同時進行。

2．了解檢驗人員的專業(yè)背景、培訓情況及工作經(jīng)歷。可通過查看學歷證書、培訓證書或當面詢問檢驗人員等方式，檢查無菌檢驗人員是否具備微生物專業(yè)知識，是否經(jīng)過無菌技術的專業(yè)培訓以及是否具有相應的檢驗工作經(jīng)驗等。

3．現(xiàn)場查看無菌實驗室。無菌檢驗應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)（如在10000級潔凈間內(nèi)配置超凈工作臺等）進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期監(jiān)測。

4．現(xiàn)場查看無菌檢驗所需的設備和器具。其中，主要設備包括：恒溫培養(yǎng)箱（真菌、細菌）和（或）恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器和（或）電熱干燥箱、電子天平、光學顯微鏡、集菌儀、過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；從試驗安全性考慮，建議陽性對照試驗使用生物安全柜。

主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75%乙醇棉、滅菌刻度吸管（1mL）、滅菌平皿（9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。

生產(chǎn)企業(yè)應采用可靠方法對與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃、30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃、2小時。器具滅菌后必須做好標識，標明滅菌的時間和使用有效期。器皿在滅菌后，應在經(jīng)驗證的保存期內(nèi)使用。

5．對照生產(chǎn)企業(yè)有關無菌檢驗的管理制度、操作規(guī)程等相關技術文件，要求檢驗人員當場操作或口述無菌檢驗的過程。

（1）培養(yǎng)基制備

生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2℃～25℃、避光的環(huán)境，并在經(jīng)驗證的保存期內(nèi)使用。

生產(chǎn)企業(yè)也可以使用商品化的預制培養(yǎng)基，應在規(guī)定的有效期內(nèi)使用。

無菌檢驗用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢驗前或與供試品的無菌檢驗同時進行。

（2）供試品的無菌檢驗

無菌檢驗方法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，對于醫(yī)療器械類產(chǎn)品，應優(yōu)先采用直接接種法。進行供試品無菌檢驗時，應進行方法適用性試驗。供試品無菌檢驗所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。

無菌操作時，如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。

（3）培養(yǎng)及觀察

含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)不少于14天。培養(yǎng)期間應定期觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液不少于1mL轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，將原始培養(yǎng)物和新接種的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)不少于4天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

（4）結果判斷

生產(chǎn)企業(yè)應按照如下標準進行判斷：

①若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；②若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則試驗無效。

當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結果無效：①無菌檢驗試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢驗方法的要求；②回顧無菌檢驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；③供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌檢驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。

試驗若經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

6．查閱試驗記錄。完整的試驗記錄應明確包含下列幾類信息：

（1）樣品記錄，至少應包括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號、取樣地點、取樣方式、取樣人、原始試驗記錄序號。

（2）滅菌物品制備記錄，至少應包括：

①培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基批號、各組分的稱取量（g）、純化水用量（mL）、培養(yǎng)基分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和時間、滅菌后pH值（冷卻至25℃測定，不得超過規(guī)定值的±0.2）、制備人、培養(yǎng)基存放地點和有效期等。

②器具：器具名稱、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和時間、制備人、器具存放地點和有效期等。

（3）原始試驗記錄，至少應包括：記錄名稱、記錄序號、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號、滅菌批號、樣品數(shù)量、取樣日期、檢驗日期、檢驗依據(jù)、主要試驗設備及器具、使用的培養(yǎng)基批號、試驗方法、試驗環(huán)境條件、試驗結果（定期觀察的結果）、試驗結論、檢測人和復核人等。

（4）廢棄物處理記錄，至少應包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數(shù)量、滅菌時間和溫度、經(jīng)辦人和處理日期等。

三、其它應注意的問題

1．生產(chǎn)企業(yè)應確保樣品具有代表性：試驗樣品應從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批次中選擇。選擇樣品是隨機的。試驗樣品的選擇和試驗前預處理方式應明確，以免對樣品造成污染，或改變樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類。試驗樣品也可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，但所選擇的不合格產(chǎn)品應該能夠代表這個生產(chǎn)批次的加工過程和條件。用于試驗的不合格產(chǎn)品應不會影響無菌測試的有效性。

2．生產(chǎn)企業(yè)對于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗結果的可靠性。選取制作供試品的試驗樣品時，樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層或兩層以上包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。

3．無菌檢驗中接觸供試品的試驗用具溫度不能過高，以防供試品上可能存在的微生物因溫度過高被滅活。對不同種類和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時，應更換試驗用具（如：剪刀、鑷子）。

4．進入無菌檢驗室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應采用適用的方法進行消毒處理（如：紫外燈照射不少于30分鐘；適用時，對供試品外包裝表面用適宜的消毒液進行徹底消毒等），以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。出具試驗結果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘的處理。

5．由于無菌檢驗時間跨度較長，因此記錄應能夠完整體現(xiàn)試驗的全過程，對于在試驗過程中出現(xiàn)的各種情況，均應在記錄中客觀反映。

6. 在進行無菌檢驗時，還應考慮消除產(chǎn)生假陰性的因素。產(chǎn)生假陰性的因素以及相應的消除措施包括：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長，應按照藥典要求進行培養(yǎng)基適用性檢查；產(chǎn)品中含有某種抑菌成分會導致微生物生長微弱、緩慢或不生長，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑或滅活劑等方式消除抑菌物質(zhì)的影響；產(chǎn)品滅菌后未進行充分的解析（如采用環(huán)氧乙烷滅菌）導致微生物被殺死，應確定滅菌后產(chǎn)品的解析時間、儲存條件及儲存時間。

附件：1.常見的名詞解釋

          2.供試品數(shù)量的選擇

          3.培養(yǎng)基的制備

          4.培養(yǎng)基的適用性檢查

          5.方法適用性試驗

          6.供試品處理及接種培養(yǎng)基

          7.對照試驗

          8.參考依據(jù)

附件1

常見的名詞解釋

1．滅菌：經(jīng)確認的使產(chǎn)品無存活微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使物品污染微生物存活概率減少到10-6及以下。

2．微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實體，包括細菌、真菌、原生動物和病毒。

3．無菌技術：是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無菌檢驗器材以及無菌操作。

4．無菌操作：是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。

5．培養(yǎng)條件：促進微生物復蘇、生長和（或）繁殖所采用的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的組合，培養(yǎng)方法可包括溫度、時間和其他規(guī)定用于培養(yǎng)的條件。

6．需氧微生物：需要氧氣進行代謝的微生物。

7．厭氧微生物：不需要氧氣進行代謝的微生物。

8．抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。

9．促生長試驗：為了證明一種培養(yǎng)基能夠支持微生物繁殖而進行的技術操作。

10．假陰性：實際陽性的無菌檢驗結果被變成了陰性。

11．假陽性：實際陰性的無菌檢驗結果被變成了陽性。

12．生物指示物：對規(guī)定的滅菌過程有特定的抗力，含有活微生物的測試系統(tǒng)。

13．化學指示物：根據(jù)暴露于某一滅菌過程所產(chǎn)生的化學或物理變化，顯現(xiàn)一個或多個預定過程變量變化的測試系統(tǒng)。

14．無菌保證水平（SAL）：滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。

15．表面活性劑：改變?nèi)芤罕砻婺埽ū砻鎻埩Γ┑某煞帧?

16．中和劑：有抑菌成分中和能力的化學有效成分。

17．滅活劑：對抑菌成分有滅活能力的化學有效成分。

18．潔凈區(qū)：需要對環(huán)境中塵粒及微生物數(shù)量進行控制的房間（區(qū)域），其建筑結構、裝備及其使用應當能夠減少該區(qū)域內(nèi)污染物的引入、產(chǎn)生和滯留。

附件2

供試品數(shù)量的選擇

檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按中國藥典2020版四部通則1101中表1規(guī)定，上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗按表2規(guī)定。表1、表2中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。執(zhí)行GB/T 14233系列標準的供試品數(shù)量應滿足標準中對于檢驗樣品數(shù)量的要求。

檢驗量是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按中國藥典2020版四部通則1101中表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。

注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中最少檢驗數(shù)量應增加相應倍數(shù)。

注：1.若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的最少檢驗數(shù)量應加倍增加相應倍數(shù)。

       2.桶裝固體原料的最少檢驗數(shù)量為4個包裝。

注：①如果醫(yī)療器械體積過大培養(yǎng)及用量可在2000mL以上，將其完全浸沒。

附件3

培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)應注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（30～35）℃14天；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20～25）℃14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進行分裝、滅菌。

1．硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

胰酪胨 15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖/無水葡萄糖 5.5g/5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸 0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 mL、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸 0.3mL）、瓊脂 0.75g、水 1000 mL

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH，使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/3 ，否則，須經(jīng) 100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。

除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 （30～35）℃培養(yǎng)。

2．胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

胰酪胨 17.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g、磷酸氫二鉀 2.5g、葡萄糖/無水葡萄糖 2.5g/2.3g、水 1000 mL

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置（20～25）℃培養(yǎng)。

3．中和或滅活用培養(yǎng)基

按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。

4．0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢驗）

胨 10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、葡萄糖 5.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為 7.2±0.2，分裝，滅菌。

5．胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

胰酪胨 15.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g、瓊脂 15.0g、水1000 mL。

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。

6．沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

7．沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖 40.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

8．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）

馬鈴薯(去皮) 200g、瓊脂 14.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL。

取馬鈴薯，切成小塊，加水1000 mL，煮沸20～30分鐘，用6～8層紗布過濾，取濾液補水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

附件4

培養(yǎng)基的適用性檢查

1．無菌性檢查

每批培養(yǎng)基一般隨機取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。

2．靈敏度檢查

菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學特性。

所用菌株包括：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]。

3．菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，（30～35）℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)2～3天，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。

接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

菌懸液若在室溫下放置，一般應在2小時內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

4．培養(yǎng)基接種

取適宜裝量的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不超過3天，接種真菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不得超過5天。

5．結果判定

空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

附件5

方法適用性試驗

1．菌種及菌液制備

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

2．薄膜過濾法

按供試品的無菌檢驗要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗菌，過濾。加培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內(nèi)加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內(nèi)加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

3．直接接種法

取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供試品的無菌檢驗要求，接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

4．結果判斷

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢驗。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。

方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢驗同時進行。

附件6

供試品處理及接種培養(yǎng)基

直接接種法：即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積（采用洗脫法時，應為洗脫液體積）不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。

薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入相應的濾筒內(nèi)。

薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，無菌檢驗用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。

附件7

對照試驗

1．陽性對照：陽性對照應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量不大于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢驗每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)不超過5天應生長良好。

2．陰性對照：供試品無菌檢驗時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

3．稀釋液、沖洗液及其制備方法

稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

（1）0.1%無菌蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時濾過使澄清，調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

（2）pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g，無水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時濾過使澄清，分裝，滅菌。

（3）根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。（如0.9%無菌氯化鈉溶液）

如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

附件8

參考依據(jù)

1.《中華人民共和國藥典》（2020年版）

2.《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法》系列標準（GB/T 14233）

3.《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法》（GB/T 16292-2010）

4.《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》（GB/T 16293-2010）

5.《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》（GB/T 16294-2010）

6.《實驗室 生物安全通用要求》（GB 19489-2008）

7.《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 術語》（GB/T 19971-2015）

8.《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學方法 第2部分：用于滅菌過程的定義、確認和維護的無菌試驗》（GB/T 19973.2-2018）

9.《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》（GB 50346-2011）

10.《醫(yī)療器械安全通用要求檢驗操作規(guī)范》，中國醫(yī)藥科技出版社（2019年）