附件：應用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導原則第三部分生物相容性毒理學評價（2024年第23號）.doc

應用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性
評價指導原則第三部分：生物
相容性/毒理學評價

本指導原則為注冊申請人/監(jiān)管人員提供關于應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價相關方面的信息。

本指導原則是對應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價的一般要求，注冊申請人應依據(jù)具體產(chǎn)品的特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充分說明和細化。注冊申請人還應依據(jù)具體產(chǎn)品的特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細闡述理由及相應的科學依據(jù)。

本指導原則是對注冊申請人和審評人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能滿足相關法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

一、適用范圍

本指導原則適用于與人體直接或間接接觸，由納米材料組成或包含納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學評價。

不適用于：

- 應用納米材料的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）產(chǎn)品；

- 應用納米材料的賦能技術（如納米機器人）；

- 應用納米材料的藥品；

- 應用納米材料的醫(yī)療器械在制造和廢棄過程中造成的職業(yè)和環(huán)境風險。

二、醫(yī)療器械中與納米材料相關的風險識別和風險評估的層級評價方法

本指導原則描述的應用納米材料的醫(yī)療器械，是指注冊申請人在醫(yī)療器械產(chǎn)品中應用了納米材料，且該納米材料被設計為發(fā)揮預期功能。此類醫(yī)療器械的生物學評價應首先執(zhí)行GB/T 16886系列標準文件及醫(yī)療器械法律法規(guī)的內(nèi)容，再結合本指導原則描述的納米材料特殊考慮點進行相關研究。納米材料的安全風險與常規(guī)材料不同，主要取決于納米材料的化學成分、物理化學性質(zhì)、納米特性、納米結構與形貌、與組織相互作用方式以及暴露途徑與水平等。相比于常規(guī)材料，納米材料在樣品制備時會有溶解性和分散性的區(qū)別，以及穩(wěn)定性和均一性的要求，因此可能需要考慮納米材料在樣品制備時的特殊性；由于納米顆粒被認為可能穿越所有生物屏障，包括血腦屏障和胎盤屏障等，因此可能需要考慮納米材料的全身毒性，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和生殖/發(fā)育毒性；“納米蛋白冠”的形成，可能會影響其生物響應、動力學、蓄積和毒性等生理效應；有些納米材料具有類佐劑特性，可能會對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，需要關注免疫毒性；納米材料被單核吞噬細胞系統(tǒng)清除、在特定組織器官分布、形成“納米蛋白冠”等，可能改變其毒代動力學特征。因此，應用納米材料的醫(yī)療器械生物學評價內(nèi)容，在兼顧GB/T 16886系列標準文件中關于常規(guī)器械評價內(nèi)容的基礎上，重點考慮與納米材料有關的其他問題，如樣品制備，吸收、分布、代謝和排泄/清除（ADME）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和免疫毒性等。對應用納米材料的醫(yī)療器械進行生物相容性/毒理學評價時，需根據(jù)GB/T 16886.1附錄A中描述的生物學評價框架開展評價，并參考GB/Z 16886.22、本指導原則第三章及附件一中所描述的納米材料特殊考慮點設計研究/試驗方案。

在對應用納米材料的醫(yī)療器械進行生物學評價時，如果納米材料吸收和分布導致納米材料的內(nèi)部暴露、反應活性、代謝動力學或生物持久性發(fā)生改變時，可能觸發(fā)進一步的試驗，用于研究非常規(guī)的評價終點（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能終點）。

為了生成有效的毒理學數(shù)據(jù)用于應用納米材料的醫(yī)療器械的風險識別和風險評估，更加高效地識別和評價特定風險，本指導原則提供了層級研究方法，用于逐步對應用納米材料的醫(yī)療器械中與納米材料相關的安全風險開展識別和評估。

層級1：注冊申請人應根據(jù)醫(yī)療器械已有信息（GB/T 16886.1）和理化表征結果判斷終產(chǎn)品中是否有納米材料，若判斷無納米材料，則按照常規(guī)醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學評價研究流程進行；若判斷有納米材料，則收集納米材料的暴露可能性、表界面生物效應等信息，必要時開展納米材料脫落和釋放研究（參見本系列指導原則第二部分：理化表征）、與接觸部位的表界面生物效應研究?；谒占畔?，可參考以下路徑進行應用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學評價：

（1）若無納米材料暴露可能性且接觸部位無納米材料相關的表界面生物效應，則按照常規(guī)醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學評價研究流程進行；

（2）若缺乏評估納米材料暴露的可能性的方法，或難以排除暴露可能性，或試驗結果證明有暴露可能性，則進行層級2的研究。

（3）若接觸部位存在與納米材料相關的表界面生物效應，則進行層級2的研究。

基于當前科學技術水平和認知，評估應用納米材料的醫(yī)療器械中納米材料暴露可能性和與接觸部位表界面生物效應的評價方法和技術手段還不夠完善，鼓勵注冊申請人根據(jù)應用納米材料的醫(yī)療器械的特性，基于個案處理原則對納米材料的脫落和釋放、與接觸部位的表界面生物效應進行研究，保證試驗方法、檢測技術等因素的可靠性，并持續(xù)更新。

層級2：對于僅在接觸部位有暴露或生物效應的應用納米材料的醫(yī)療器械，主要考察與局部效應相關的試驗終點，必要時進行毒代動力學研究，考察局部組織分布特征，還應關注納米材料向引流淋巴結遷移及進入血液引發(fā)全身效應的風險；對于有潛在全身暴露或全身效應的應用納米材料的醫(yī)療器械，主要針對常規(guī)評價終點進行研究/試驗，同時增加特殊指標的檢測，考察是否有潛在的特殊毒性風險，如免疫毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性等，并進行毒代動力學研究，考察主要組織器官的分布、蓄積和清除特性，來決定是否有必要進行深入研究。

層級2的步驟如下：參考GB/T 16886.1附錄A選擇評價終點，并按照應用納米材料的醫(yī)療器械評價要求設計試驗，具體參見本指導原則附件一。GB/T 16886.1附錄A列出了一個制定生物學評價的框架，除適用于常規(guī)醫(yī)療器械外，也適用于應用納米材料的醫(yī)療器械。但由于納米材料或納米結構可能引發(fā)非預期的生物學效應，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應用納米材料的醫(yī)療器械在某些生物學評價終點有額外的安全風險考慮點，可在層級2開展相關研究。因此，注冊申請人應結合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個案處理的原則，提供評價終點選擇的理由，并闡述評價終點選擇的科學性和合理性。

以下內(nèi)容為納米材料生物相容性與常規(guī)材料生物相容性研究差異性的舉例，具體內(nèi)容詳見附件一：

· 細胞毒性：根據(jù)細胞攝取納米材料的能力，以及納米材料與細胞的相互作用模式考慮需增加的試驗。采用合適的細胞來測試納米材料在靶器官、接觸部位細胞、免疫細胞的攝取及生物效應，如肝、腎為潛在靶器官時，可選擇HepG2人源肝癌細胞、LLC-PK1豬腎近曲小管細胞等進行試驗。

· 致敏反應：若納米材料具備一定的透皮性或局部反應風險，僅進行GPMT試驗不足以評價納米材料的致敏反應，可考慮增加體外替代方法并驗證方法的適用性，如直接肽反應性測定法（DPRA）、人細胞系激活試驗（H-CLAT）、KeratinoSens和SenCeeTox等方法。

· 亞慢性全身毒性：該試驗建議增加附加毒性終點相關檢測指標，如生殖系統(tǒng)毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等終點的相關敏感指標的檢測。

慢性毒性、致癌性、生殖/發(fā)育毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾等附加毒性終點一般不作為層級2的首批評價終點，但需在層級2的其他試驗中增加與上述終點相關的敏感指標的檢測，作為是否進入層級3的依據(jù)，如在亞慢性全身毒性試驗中增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能觀察組合指標的檢測，考察應用納米材料的醫(yī)療器械是否有潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

若層級2的研究結果未發(fā)現(xiàn)附加毒性終點相關毒性指征的改變，一般無需進入層級3的研究，而是考察層級2的研究結果是否足以進行生物相容性/毒理學風險評估，若研究結果不足以進行生物相容性/毒理學風險評估，則需修正試驗條件重復層級2相關研究內(nèi)容，直至完成生物學評價，或根據(jù)研究結果停止生物學評價研究。

若層級2研究結果提示明確的附加毒性終點相關毒性指征，則進入層級3的研究。這些毒性指征包括但不限于納米材料存在消除緩慢、在特定的組織器官內(nèi)有蓄積的潛力、需要更長時間的代謝數(shù)據(jù)，或毒性特征提示需要關注特定組織/器官的毒性等。此外，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應用納米材料的醫(yī)療器械存在生殖系統(tǒng)毒性、免疫毒性等安全性風險時，可考慮直接進行層級3的相關研究。

層級3：是對層級2中發(fā)現(xiàn)的應用納米材料的醫(yī)療器械附加毒性終點相關毒性指征發(fā)生明顯改變時，開展與毒性指征相對應的全面的特殊試驗，如生殖/發(fā)育毒性試驗、致癌性試驗、免疫毒性試驗、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性試驗、或內(nèi)分泌干擾試驗等，參見本指導原則附件一，同時伴隨相應試驗開展毒代動力學研究，考察所關注的特殊組織器官中納米材料暴露、分布和蓄積特征。注冊申請人應結合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個案處理的原則，提供評價終點選擇的理由，并闡述評價終點選擇的科學性和合理性。

完成層級3的研究后，結合層級2和層級3的研究結果考察是否足以進行生物相容性/毒理學風險評估。若層級2、層級3的研究結果足以進行生物相容性/毒理學風險評估，不必再進行其他試驗；否則應重復層級2或?qū)蛹?的相應研究內(nèi)容，直至完成生物學評價，或根據(jù)研究結果停止生物學評價研究。

圖1 醫(yī)療器械中與應用納米材料相關的風險識別和風險評估的層級評價方法流程圖

a.現(xiàn)有GB/T 16886.1 附錄A，以及ISO/TR 10993.22（等同轉化為GB/Z 16886.22）所提供的框架用于應用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學評價是有限的，需要結合其納米特性和暴露特征考慮增加評價終點。

b.如層級2研究結果提示應用納米材料的醫(yī)療器械存在安全性風險，如蓄積、特定器官或系統(tǒng)毒性、則在層級3中針對層級2的發(fā)現(xiàn)進行進一步研究。如層級2中發(fā)現(xiàn)生殖器官有納米材料分布，應在層級3中開展對生殖功能影響等毒性試驗，并進行伴隨毒代動力學，考察所關注的特殊組織器官、關鍵組織器官中納米材料暴露、分布和蓄積特征。

c.如果出現(xiàn)以下情況，需要考慮重復進行層級2或?qū)蛹?相關試驗研究，如完善試驗設計、試驗結果存在爭議、試驗結果提示需要補充研究內(nèi)容等。

d.完成生物學評價后，可進行產(chǎn)品的獲益-風險評價，或者停止生物學評價，對產(chǎn)品重新進行研究和開發(fā)。

三、生物相容性/毒理學評價

（一）引言

對應用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學的評價包括文獻綜述、生物信息學、體外和體內(nèi)試驗等一系列研究。對于醫(yī)療器械，任何試驗的選擇策略均基于其預期用途/適用范圍。體內(nèi)研究應采用與醫(yī)療器械和/或納米材料人體暴露途徑相關的接觸途徑進行。所有試驗均應按照現(xiàn)行/有效的最佳實驗室/治療規(guī)范進行，數(shù)據(jù)應由經(jīng)過培訓且有經(jīng)驗的專業(yè)人員進行分析解讀。對應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價應依據(jù)以下原則：

1.進行多層級評價研究原則

應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學測試策略由其潛在外部和內(nèi)部暴露特征決定。當理化表征、暴露評估等確定醫(yī)療器械有納米材料暴露的可能性時或相關表界面生物效應時，除按照GB/T 16886系列國家標準、GB/T 42062通用要求進行相應的試驗外，還應基于納米材料風險評估的要求，參考GB/T 37129、GB/Z 16886.22，按照與納米材料相關的風險識別和風險評估的層級評價方法流程圖進行多層級評價研究，考慮是否增加額外毒性關注指標，以及深入開展附加毒性試驗。

2.遵循個案處理原則

按照GB/T 16886.1的要求，醫(yī)療器械的生物學評價試驗策略均應基于醫(yī)療器械分類、接觸性質(zhì)和暴露持續(xù)時間等進行考慮。由于應用納米材料的醫(yī)療器械情況復雜，本指導原則不可能涵蓋所有應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價的全部內(nèi)容。針對某一具體產(chǎn)品，其生物相容性/毒理學評價應遵循個案處理的原則。

3.確認測試系統(tǒng)的適用性原則

納米材料的溶解或分散狀態(tài)、樣品制備方法、劑量設計、細胞品系、動物種屬等測試系統(tǒng)參數(shù)都可能影響試驗結果的可靠性，故需確認測試系統(tǒng)是否適用于評價應用納米材料的醫(yī)療器械，如樣品制備方法不適用于應用納米材料的醫(yī)療器械時，可考慮直接使用醫(yī)療器械終產(chǎn)品或代表性樣品進行相關試驗。目前可用于應用納米材料的醫(yī)療器械生物學評價的專屬試驗方法尚在開發(fā)中，可參考的試驗方法較少，已發(fā)布并正式實施的相關標準主要包括內(nèi)毒素試驗（YY/T 1295）、細胞毒性試驗（GB/T 41212、GB/T 41915、YY/T 0993）、體外溶血試驗（YY/T 1532）。因此，注冊申請人應確認測試系統(tǒng)的適用性，提供適合所申報產(chǎn)品特點的生物學評價資料。一些體外試驗可能對于篩選目的及作用機制的研究是有用的，但這些方法的使用必須基于個案處理原則。目前經(jīng)過確認的體外方法參見歐洲替代方法驗證中心（EURL ECVAM）發(fā)布的方法。

4.生物組織中納米材料的表征原則

納米材料和生物組織中的生物分子相互作用可能獲得新“生物學特征”，即在表面吸附蛋白質(zhì)等生物分子（蛋白冠、生物冠）時產(chǎn)生的新性質(zhì)，可影響機體的生理響應及毒理學特征。因此，納米材料在試驗條件下的實際存在形式、特性和穩(wěn)定性等信息對于任何試驗結果的解釋都是至關重要的。應在試驗開始和結束時（若可行）對生物組織中的納米材料進行表征。

5.毒代動力學數(shù)據(jù)判定原則

證明納米材料在細胞和/或組織中有暴露是解釋研究結果的關鍵（特別是陰性結果），缺乏這類數(shù)據(jù)對得出最終結論可能造成很大的不確定性。因此，在技術可行的情況下，應確定納米材料是否分布在組織或細胞的特定區(qū)域，明確在試驗系統(tǒng)中的暴露量。

（二）應用納米材料的醫(yī)療器械生物學評價試驗的核心關注點

1.樣品制備

溶解和分散：納米材料與溶解的化學物質(zhì)不同，通常為不溶或部分溶解的納米顆粒以混懸/分散和/或更大的團聚和聚集狀態(tài)存在。試驗介質(zhì)/制劑（及其成分）可能影響納米材料的特性和性能。當采用體內(nèi)或體外方法對不溶或部分溶解納米顆粒進行測試時，一定要重點考慮納米材料在介質(zhì)中的分散狀態(tài)。

樣品制備：取樣和樣品制備通常是整個分析過程中至關重要的步驟，也可能是結果不確定性的最大來源。納米材料樣品制備中的一個關鍵問題是顆粒的適當分散。目前尚無專門應對納米材料樣品制備的標準文件，注冊申請人可參考GB/T 16886.12提供的樣品制備通用要求進行樣品制備。此外，建議注冊申請人對樣品制備的分散情況和穩(wěn)定性進行測試并記錄。

2.濃度/劑量

納米材料濃度/劑量可能因其團聚、聚集、沉淀、與介質(zhì)中的物質(zhì)結合，或吸附在容器上而降低。為了確保在試驗期間使用的濃度/劑量保持穩(wěn)定，任何體內(nèi)、體外毒性試驗應特別關注納米材料的團聚/聚集、解聚和重聚集行為，以及納米材料的不溶/部分溶解性質(zhì)，考察納米材料在試驗介質(zhì)中的穩(wěn)定性和均一性，以確保所用的納米材料的濃度/劑量與預期一致。

此外，在一些試驗中，使用過高的濃度或劑量可能會改變納米材料的物理化學特性（如形成團聚體等次級粒子），導致吸收、毒性降低，甚至獲得與材料固有毒性無關的結果，如吸入研究中過度負荷劑量、遺傳毒性中過高濃度導致細胞毒性等。因此，申請人應提供選擇高濃度或劑量的依據(jù)和理由。

3.劑量單位

常規(guī)材料通常使用重量或體積劑量單位進行檢測、表示以及風險評估（例如mg/kg，或mg/L）。然而，對于納米材料來說，潛在生物相互作用不直接依賴于分子的濃度或數(shù)量，而依賴于納米材料/納米物體本身。納米毒理學的劑量-反應關系可能與納米物體數(shù)量或表面積等納米特征參數(shù)更相關。因此，使用比表面積、顆粒數(shù)量等劑量單位描述納米材料的劑量-反應關系可能更加合適。也可使用納米材料表征中得出的其他參數(shù)來表示劑量。在合適的參數(shù)識別出來之前，重要的是描述不同的劑量度量，如質(zhì)量-體積濃度、顆粒數(shù)量濃度、比表面積等，為基于質(zhì)量的劑量換算成其他參數(shù)提供足夠的信息。

4.對試驗系統(tǒng)的干擾

內(nèi)毒素的干擾：納米材料分散體系中存在的內(nèi)毒素可能干擾試驗系統(tǒng)，并隨試驗系統(tǒng)的不同導致假陰性或假陽性結果。

對基于光學原理試驗方法的干擾：納米材料可能與試驗系統(tǒng)或試劑相互作用，特別是在比色試驗中（例如用于細胞活性試驗的磺酰羅丹明B，或MTT）。另外，一些納米材料本身對光有散射/吸收，也可能干擾比色試驗測定。這些因素需要在使用比色方法時加以考慮。

與生物分子作用：試驗系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)/生物介質(zhì)（如細胞因子）也可能吸附到納米材料表面，造成低響應甚至是假陰性結果。

對于此類問題，建議增加合適的對照品或?qū)ΜF(xiàn)有方法進行調(diào)整。例如，納米材料已被證明可干擾基于四唑化合物的試驗，如MTS和MTT法的吸光度檢測?？稍谧x數(shù)前通過離心除去納米材料，以降低由納米材料產(chǎn)生的數(shù)據(jù)變異度。

5.可能的毒性機制

解離離子的毒性：一些金屬（銀）、金屬氧化物（氧化鋅）或無機非金屬/陶瓷材料在生物介質(zhì)中會（緩慢）溶解/降解，檢測的部分（或全部）毒性效應可能都源于溶解/降解產(chǎn)生的離子。對于這類納米材料，應在試驗之前和試驗期間測定溶解/降解的部分所占比例，并增加合適的離子形式對照組。

與尺寸相關的毒性：納米材料的毒性可能源自其尺寸效應，易于進入生物系統(tǒng)，被炎性細胞吞噬，特別是巨噬細胞和多核嗜中性粒細胞。納米材料可吸附蛋白質(zhì)和多肽形成新的蛋白質(zhì)復合物，或改變蛋白質(zhì)結構，促進蛋白質(zhì)降解，觸發(fā)炎性細胞的應答過程。因此，應關注尺寸效應與毒性的相關性，以進行風險評估。

納米材料形貌對吞噬作用的影響：納米材料的軟硬度、剛性、拓撲結構對細胞攝取、細胞內(nèi)定位、細胞內(nèi)吞機制均具有影響。例如，球狀納米顆粒被細胞內(nèi)吞的過程比棒狀或纖維狀納米材料容易和迅速。對于這類納米材料，應關注不同納米形貌結構對細胞攝取與毒性的影響。

（三）生物相容性/毒理學試驗

本指導原則旨在為經(jīng)過培訓的專業(yè)人員提供在醫(yī)療器械評價方面對應用納米材料的醫(yī)療器械進行生物相容性/毒理學評價的通用方法，并在附件一中討論如何基于GB/T 16886系列標準文件、GB/Z 16886.22，及應用納米材料的醫(yī)療器械特殊考慮點來設計試驗，包括試驗設計、細胞/動物模型選擇、研究終點選擇、結果解釋等內(nèi)容。

本指導原則代表了現(xiàn)有認知水平下監(jiān)管部門對應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價終點的考慮及應對措施，未來隨著毒理學和納米材料轉歸方面的認知增長，更多試驗方法的缺陷可能會顯現(xiàn)出來，本指導原則的內(nèi)容將隨著納米材料生物相容性/毒理學評價研究的不斷推進而完善。因此，建議注冊申請人關注研究最新進展，并在開展應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學評價時加以考慮，以保持對應用納米材料的醫(yī)療器械生物學評價最新技術的持續(xù)更新。

四、參考文獻

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五、編寫單位

本指導原則由國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心牽頭，國家納米科學中心、廣東粵港澳大灣區(qū)國家納米科技創(chuàng)新研究院、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院、中國食品藥品檢定研究院參與編寫，由國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心負責解釋。

附件一 應用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學研究相關內(nèi)容

（一）細胞毒性試驗

作為生物相容性/毒理學評價的一部分，細胞毒性試驗的結果可以作為納米材料潛在暴露和危害的證據(jù)，并確定其作用機制，有助于體內(nèi)試驗的設計和解釋?？砂凑誈B/T 16886.5、YY/T 0993和ASTM E2526的要求，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)和暴露信息合理開展應用納米材料的醫(yī)療器械的細胞毒性試驗。

納米材料的細胞毒性依賴于細胞對其敏感性、特定受體的存在或攝取機制。納米材料可通過氧化應激誘導細胞毒性，并在進入細胞后與細胞內(nèi)不同成分相互作用并干擾細胞功能。此外，納米材料也可能通過離子釋放引起細胞毒性。根據(jù)應用納米材料的醫(yī)療器械的預期接觸部位和可能接觸的細胞類型，一般可選擇非吞噬性細胞（如3T3小鼠成纖維細胞，L929小鼠成纖維細胞，HaCaT人源角質(zhì)形成細胞）和吞噬性細胞（如RAW264.7 小鼠巨噬細胞，THP-1人源已分化巨噬細胞）進行試驗。為了獲得納米材料的危害和作用模式信息、以及暴露情況，鼓勵注冊申請人在能力可及范圍內(nèi)測試有代表性的靶組織部位細胞、接觸部位細胞、免疫細胞等類型。

可以考慮的特定終點包括細胞活力/細胞毒性（MTT、MTS、LDH法等）、氧化應激反應、DNA合成（BrdU法）、能量代謝（測定ATP）、（促）炎癥反應（作為免疫毒性的一部分）和組織屏障穿透性等。如適用時，可考慮直接接觸法評價應用納米材料的醫(yī)療器械的細胞毒性。

（二）遺傳毒性試驗

應用納米材料的醫(yī)療器械的遺傳毒性試驗應遵循醫(yī)療器械GB/T 16886.1、GB/T 16886.3的一般性原則，建議結合納米材料的特性，以遺傳毒性標準組合試驗為基礎開展遺傳毒性評價，遺傳毒性評價方法選擇可參考GB/T 16886.3。

細胞對納米材料的攝取能力是影響其體外遺傳毒性評價結果的關鍵因素。細菌回復突變試驗可能不適合檢測某些具有抑菌性或無法進入細菌內(nèi)的納米材料。體外哺乳動物細胞試驗建議使用可攝取納米材料的細胞系，試驗設計時應考慮到納米材料在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的濃度和作用時間，并對細胞攝取納米材料的能力進行分析。

如果至少有一項體外遺傳毒性試驗結果陽性，可參考GB/T 16886.3附錄B中的后續(xù)評價流程圖選擇適宜的體內(nèi)試驗評價其遺傳毒性風險。應根據(jù)最常見的體內(nèi)暴露途徑選擇適宜的體內(nèi)試驗暴露方式，并需通過適當方式確定納米材料在檢測組織中有一定暴露且不會被快速清除。

（三）急性毒性

醫(yī)療器械急性毒性試驗相關標準（GB/T 16886.11、GB/T 16886.12）的一般要求也適用于應用納米材料的醫(yī)療器械。樣品制備時，應說明分散體系選擇的合理性。GB/T 16886.11以外的急性毒性試驗信息可以在下述標準中找到：急性經(jīng)口毒性試驗固定劑量法（GB/T 21804），急性毒性分類方法（GB/T 21757），或者上下增減劑量法（GB/T 21826）。吸入途徑急性毒性分級方法在GB/T 21605和GB/T 28648中描述，體內(nèi)急性皮膚毒性試驗在GB/T 21606及 GB/T 21604中描述。

（四）刺激性

納米材料的生物效應可能導致其穿透皮膚、眼睛或黏膜以及被攝取，應考慮適宜的模型評價納米材料的刺激性。GB/T 16886.23的一般要求也適用于納米材料。此外，當局部組織生理狀態(tài)改變時，如分泌汗液的皮膚、機械損傷的表面、病理學病癥、光損傷等，對納米材料的屏障效應也可能發(fā)生相應改變，導致不同的刺激性。因此，選擇的試驗方法應能充分模擬應用納米材料的醫(yī)療器械的臨床具體使用條件和暴露途徑。

已有一些體外替代試驗（如大鼠皮膚經(jīng)皮電阻抗試驗，OECD 430；EpiSkin?, EpiDerm?, SkinEthic?, EST-1000，OECD 431）被驗證用于評價化學品的刺激性。若注冊申請人采用體外替代方法進行納米材料的醫(yī)療器械刺激性試驗時，需要提供詳細的研究資料和驗證資料。關于體外替代方法的相關內(nèi)容，將在本系列指導原則第五部分：體外替代測試方法/計算機模擬研究中給出。

（五）皮膚致敏反應

納米材料的大比表面積，類佐劑效應以及與蛋白質(zhì)形成的復合物都可能會導致過敏。GB/T 16886.10描述了評估醫(yī)療器械及其成分誘發(fā)皮膚致敏反應的試驗方法，即鼠科動物局部淋巴結測定（LLNA）、豚鼠最大劑量試驗（GPMT），以及封閉式貼敷試驗。由于納米材料的低皮膚穿透性，LLNA和封閉式貼敷試驗可能檢測不出致敏潛力，陰性試驗結果不能被解釋為納米材料無致敏性。GPMT試驗盡管局部誘導期和激發(fā)均使用完整皮膚，但由于首次誘導為皮內(nèi)途徑，可能是目前檢測納米材料致敏性最相關的試驗。

目前，采用GPMT試驗評價納米材料的實驗數(shù)據(jù)非常有限?；诂F(xiàn)有知識，不能依賴單一特定的試驗方法來研究納米材料?？梢詢?yōu)先考慮GPMT法，再結合個案分析原則，確定最終的試驗組合。建議注冊申請人根據(jù)應用納米材料的醫(yī)療器械特性，基于個案分析的原則，選擇適用的試驗方法，并保持試驗方法的持續(xù)更新。

（六）血液相容性

目前缺乏專用于評價與血液直接或間接接觸的應用納米材料的醫(yī)療器械血液相容性的標準方法，體外條件下的溶血、血液學、凝血、血小板激活和補體激活試驗均可以為納米材料血液相容性提供有效的參考。

對于表面具有納米材料/納米特征的醫(yī)療器械，可直接按照GB/T 16886.4開展血液相容性評價，推薦以器械表面積/血液體積的比例計算接觸體系。由于游離納米材料比常規(guī)材料有更高的比表面積，其血液相容性評價更具有挑戰(zhàn)性，在參考GB/T 16886.4、YY/T 1532進行試驗時，需特別關注納米材料特性對其進入血液后的級聯(lián)反應的影響，以及納米材料在介質(zhì)中的表征結果。

若體外試驗不足以評價納米材料的血液相容性，可考慮結合體內(nèi)試驗進行評價，將納米材料注射到循環(huán)系統(tǒng)并評價其分布以及任何局部和全身不良反應，如血管損害、血液學、血生化相關指標的改變，并參考GB/T 16886.4進行補體激活、凝血級聯(lián)激活、血小板激活等試驗評價納米材料的血液相容性。

除了血液相容性常規(guī)項目外，建議考慮納米材料與吞噬細胞的潛在相互作用。目前尚無評價納米材料與吞噬細胞相互作用的標準方法。推薦增加內(nèi)皮細胞和/或單核細胞激活評估（如評價細胞黏附分子標志物、促炎因子、促凝因子等）。

此外，新技術（如微流控）可能用于評價納米材料與內(nèi)皮細胞和/或血管的相互作用。

（七）毒代動力學

1. 引言

GB/T 16886.16的一般性原則也適用于應用納米材料的醫(yī)療器械。與常規(guī)材料不同，組織器官可能快速攝取納米材料而不依賴于其在血液中的濃度。納米材料在組織中的分布、蓄積以及消除可能比在血漿中的暴露特征更能代表真實的暴露情況，尤其是在典型的攝取器官、靶器官中的分布情況，如肝、脾、肺等。另外，多次接觸可能導致納米材料在一些組織器官中蓄積和長期保留，應重點考察納米材料在組織器官中的分布、蓄積和消除特征。此外，腎可能是納米材料排泄的重要器官。為了識別納米材料的組織分布、蓄積和滯留潛力，有必要設計單次和多次接觸的毒代動力學研究，并合理延長樣本采集時間點。

接觸途徑可能影響納米材料的動力學特征。如當氣管內(nèi)接觸金納米顆粒（1.4 nm）時，腎臟暴露量比肝更高，而采用靜脈接觸后，肝成為最主要的靶器官。應用納米材料的醫(yī)療器械表面分子粘附，不僅影響納米材料的脫落和釋放，還可能促進單核巨噬細胞系統(tǒng)（MPS）對納米材料的識別和攝取，以及經(jīng)淋巴系統(tǒng)遷移或轉運，以及二次組織分布。如果從醫(yī)療器械中釋放的納米材料可能被吸收、分布、代謝和/或排泄，即需要進行毒代動力學研究。

2. 納米材料毒代動力學研究方法

開展應用納米材料的醫(yī)療器械的毒代動力學研究時，建議基于層級評價流程（正文第三部分）逐步進行。在層級1中，收集納米材料暴露信息，必要時開展應用納米材料醫(yī)療器械的脫落和釋放體外和/或體內(nèi)試驗,進行納米材料的暴露可能性評估。在層級2中，可在其他試驗中增加衛(wèi)星組進行伴隨毒代動力學研究或單獨開展毒代動力學研究，考察納米材料在主要組織器官中的分布、蓄積和清除特性。在層級3中，通常伴隨其它試驗開展毒代動力學研究，考察納米材料在特殊組織器官中的分布、蓄積和消除特性，如伴隨生殖/發(fā)育毒性試驗開展毒代動力學研究，對胎盤、乳汁中的納米材料進行定性和定量分析。

定量分析方法一般可采用元素分析法對納米材料化學組成進行定量分析，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）、原子吸收光譜-質(zhì)譜法（AAS-MS）等。現(xiàn)有的檢測方法中，含金屬元素的納米材料相比于其他納米材料更容易被檢測。但檢測出特定的元素并不能證明材料以納米形式存在，還需進行納米材料的定性分析，可參考本系列指導原則第二部分：理化表征。具體研究時，建議先采用定量分析方法對樣品中的元素進行檢測，若有特征元素存在，再采用納米材料特異性的方法進行定性分析，考察化合物是否以納米形式存在。

放射性同位素或熒光染料標記方法可用于標記納米材料，跟蹤納米材料的生物轉化和生物轉運過程，測定生物樣品中母體物質(zhì)和代謝物的總量。但某些標記可能引起納米材料的表面化學變化，從納米材料中脫離，干擾毒代動力學研究。因此，當使用標記技術時，需要考察標記-納米材料組合物的完整性，以及對毒代動力學特征和毒性的影響，評估方法的可用性和安全性，確保標記物在接觸和進入體內(nèi)后按預期發(fā)揮作用，且不改變納米材料的毒代動力學行為。

3.不同接觸途徑的應用納米材料的醫(yī)療器械毒代動力學關注點

（1）經(jīng)皮膚接觸途徑：應關注皮膚損傷狀態(tài)，以及溶劑和載體效應等因素，對納米材料穿透皮膚角質(zhì)層和吸收的影響。

（2）非經(jīng)皮膚接觸途徑：

a.眼暴露攝入：納米材料可能到達眼部深處組織，應關注納米材料在眼部的釋放和代謝動力學數(shù)據(jù)。

b.呼吸道暴露攝入：納米材料除暴露于肺部，也可能存在全身暴露的情況，肺部清除的半衰期可能高達2個月，應關注全身暴露可能性，及緩慢清除特征。

c.經(jīng)消化道暴露攝入：納米材料在消化道暴露的量通常較低，但小尺寸納米材料可能被攝取，應關注納米材料粒徑對暴露的影響，可以使用胃腸道體外模型來研究納米材料在腸道的轉運。

d.皮下暴露攝入（植入物）：可以通過皮下注射作為經(jīng)皮植入分布研究的替代方法，并關注納米材料在淋巴結、肝、脾和肺等器官的顆粒團聚現(xiàn)象。

（八）熱原

由于納米材料表面極易吸附微生物及其產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（LPS），干擾納米材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用，增加熱原反應風險。應用納米材料的醫(yī)療器械細菌內(nèi)毒素檢測可參考YY/T 1295給出的試驗方法進行。除細菌內(nèi)毒素介導的致熱性外，也需考慮納米材料介導的致熱性，可參考GB/T 16886.11給出的試驗方法進行測試。

（九）植入

GB/T 16886.6中提供了不同組織（皮下、肌肉、骨、腦）局部植入的標準方法，也適用于降解和非降解納米材料、固體和非固體納米材料如多孔材料、液體、凝膠、膏狀和粉末等不同形態(tài)。

對于非降解納米材料，短期反應評估一般為1周至4周，長期反應評估則一般超過12周。在肌肉和結締組織中，植入后9周至12周時細胞群呈穩(wěn)定狀態(tài)，在骨組織中，則可能需要較長的觀察期才能達到穩(wěn)定狀態(tài)，須基于個案處理原則。而對于可降解材料，組織反應的穩(wěn)定狀態(tài)通常取決于納米材料在組織中的降解特性。納米材料在降解過程中可能與局部組織持續(xù)發(fā)生相互作用，故需要監(jiān)測更多的觀察周期以覆蓋典型的組織變化節(jié)點，還應關注所產(chǎn)生納米顆粒在局部沉積引起的局部組織學效應，以及向引流淋巴結遷移及進入血液引發(fā)全身效應的風險。

盡管GB/T 16886.6不用于全身毒性、致癌性、致畸性或致突變性的評估，但如果在植入研究過程中，同步滿足了GB/T 16886.11全身毒性的要求，則可以進行局部反應和全身反應的聯(lián)合研究。

（十）亞慢性毒性試驗

GB/T 16886.11中提供了醫(yī)療器械在適當?shù)谋┞锻緩胶蜁r間的多次接觸毒性試驗方法。由于醫(yī)療器械涉及的材料類型多、形態(tài)復雜、預期用途范圍廣等特點，故在全身毒性試驗設計中應根據(jù)納米材料的特性考慮特定的方法。

應當考慮臨床預期用途/適用范圍、終產(chǎn)品狀態(tài)、暴露特征等因素，在最恰當?shù)臈l件下開展亞慢性毒性試驗，以便模擬人體暴露情況。如直接應用終產(chǎn)品不可行，應使用終產(chǎn)品的代表性樣品進行測試。

短期的亞慢性毒性試驗可提供初步的劑量探索和毒代動力學數(shù)據(jù)，用以發(fā)現(xiàn)重點關注的靶器官。亞慢性毒性試驗可設置衛(wèi)星組進行伴隨毒代動力學研究，也可單獨開展毒代動力學研究。對于經(jīng)血液接觸的應用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良的28天毒性試驗，對于其他途徑接觸的應用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良90天毒性試驗，并應根據(jù)所研究的納米材料特性及臨床接觸時間，評估28天或90天試驗是否足夠。在該試驗中，除了關注一般全身毒性反應外，還應重點關注心血管系統(tǒng)（如納米尺度團聚物在血管內(nèi)形成）、炎癥指標、涉及吞噬系統(tǒng)的組織/器官（如肝、脾、腎、骨髓和肺等），以及需要盡可能評估納米材料的潛在神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性或內(nèi)分泌介導效應，進行初步危害表征和危害評估，為風險評估提供信息，為進一步深入研究提供依據(jù)。與組織、器官存在長期、持久接觸的應用納米材料的醫(yī)療器械，需要重點關注接觸組織、器官的潛在毒性風險，如與生殖器官、胚胎或胎兒長期或持久接觸的應用納米材料的醫(yī)療器械，可能需要重點關注潛在的生殖發(fā)育毒性風險。

（十一）需要附加考慮的試驗

1. 慢性毒性/致癌性試驗

慢性毒性試驗：GB/T 16886.11的一般性原則也適用于應用納米材料的醫(yī)療器械，建議結合納米材料特性進行試驗。

致癌性試驗：GB/T 16886.3描述了致癌性試驗的一般要求。醫(yī)療器械中使用的常規(guī)材料已經(jīng)有相關知識，很少考慮開展致癌性研究，而納米材料的相關信息有限，應基于個案處理原則進行試驗。若應用納米材料的醫(yī)療器械遺傳毒性試驗陽性，降解周期超過30天或與人體持久接觸時，應結合納米材料和/或其浸提物潛在暴露信息、人體使用史等論證開展致癌性試驗的必要性和合理性。

最常見的評估化學品致癌潛力的體內(nèi)試驗是：

a) 致癌性試驗 [EC B.32, OECD 451]；

b) 慢性毒性/致癌性聯(lián)合試驗 [EC B.33, OECD 453]；

慢性毒性和致癌性研究一般是在單一物種中進行，通常選擇大鼠，可以單獨進行研究，也可聯(lián)合進行，若聯(lián)合研究，應特別注意劑量是合適的，確保到研究終點時存活動物的數(shù)據(jù)可進行統(tǒng)計分析。當首選物種出現(xiàn)可疑結果或者特定發(fā)現(xiàn)，或需要專門研究所觀察到的毒性或者致癌性的作用機制時，則需要進行第二個物種的致癌性研究。

2. 生殖和發(fā)育毒性試驗

GB/T 16886.3關于生殖和發(fā)育毒性的策略也適用于應用納米材料的醫(yī)療器械。

亞慢性毒性試驗及毒代動力學研究可獲得應用納米材料的醫(yī)療器械的生殖系統(tǒng)毒性信息，如對生殖器官的影響、生殖器官中納米材料分布和蓄積等特征、動情周期（如果需要）、性激素（如果需要）的影響等，但不能評估對生育力和整個生殖周期（從性成熟到受孕、妊娠、分娩和分娩后發(fā)育）的影響，即發(fā)育毒性。建議根據(jù)層級2中改良亞慢性毒性試驗的毒性特征及暴露情況，綜合考慮是否在層級3中開展生殖和發(fā)育毒性試驗。若應用納米材料的醫(yī)療器械已有信息顯示具有一定生殖和發(fā)育毒性風險，需要進行試驗，可先進行OECD 421，以提供可能影響生殖和（或）發(fā)育的初步信息。

在缺乏證據(jù)可以排除生殖/發(fā)育風險的情況下，應考慮進行生殖和發(fā)育毒性試驗。需按照OECD 414 （胎兒發(fā)育毒性試驗）, OECD 415 （一代生殖毒性試驗）, OECD 416 （二代生殖毒性試驗）開展試驗，并對方法的適用性進行個案處理。

若需評價子代發(fā)育毒性，可在一代生殖毒性試驗中結合生殖系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和行為學研究、免疫系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)分泌研究等數(shù)個毒性終點，評估妊娠期、哺乳期和青春期的暴露對生育和生殖功能的短期到長期的影響，以及對離乳前仔代和離乳后仔代的影響。當需要充分表征人體暴露風險時，可能需要考慮評估到F2代。

生殖/發(fā)育毒性試驗注意事項：

a. 一般使用臨床暴露途徑，并基于個案分析原則，考慮暴露途徑的可行性。如宮內(nèi)節(jié)育器等醫(yī)療器械，若直接采用臨床暴露途徑可能會影響動物受孕以及胎仔發(fā)育；腹膜內(nèi)接觸可能導致納米材料直接注射到子宮或穿過子宮壁，影響發(fā)育中的胚胎/胎兒；壓力環(huán)境及每天超過6小時不進食水，導致經(jīng)鼻吸入暴露途徑不適用于懷孕雌性動物。

b.建議盡可能開展伴隨毒代動力學研究，如在發(fā)育毒性研究中，納米材料可能經(jīng)母乳暴露于子代，故應對母乳中納米材料進行定性和定量分析。

3. 免疫毒性

免疫反應在層級2的研究中可能會被擴大或首次出現(xiàn)，評價納米材料對免疫系統(tǒng)的作用可以基于層級2中的試驗結果對免疫毒性進行綜合評估，在個案處理原則上考慮層級3的試驗內(nèi)容。

在亞慢性和慢性毒性試驗中，通常提供血液學和血生化數(shù)據(jù)，以及脾細胞和/或骨髓細胞的表型分析（T-、B-、NK細胞）。EOGRTS試驗需設置額外的組用于評估暴露對免疫系統(tǒng)發(fā)育的潛在影響，并提供免疫球蛋白IgM對T細胞依賴抗原（如綿羊紅細胞(SRBC)或血藍蛋白 (KLH)）反應的信息。

如果需要進一步評估應用納米材料的醫(yī)療器械的免疫毒性，可采用體外模型評估免疫細胞的吞噬功能、趨化性、炎性因子、一氧化氮產(chǎn)生和信號通路等指標。建議采用證據(jù)權重方法綜合評估應用納米材料的醫(yī)療器械的免疫毒性風險。

4. 神經(jīng)毒性

應用納米材料的醫(yī)療器械的潛在神經(jīng)毒性信息可從改良的亞慢性毒性試驗中獲得，相關指標包括臨床體征的改變、功能性觀察組合試驗（FOB）和自主活動、腦臟器系數(shù)（在沒有明顯毒性的情況下），以及神經(jīng)系統(tǒng)組織病理學改變等，如有必要，可增加神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)元結構及炎癥因子等指標。其他如體外神經(jīng)毒性試驗、交叉參照或提示具有神經(jīng)毒性潛能的物理化學性質(zhì)等信息也應予以綜合考慮。

層級2發(fā)現(xiàn)潛在神經(jīng)毒性時，應基于個案處理原則考慮在層級3進行深入的神經(jīng)毒性試驗，從而確認或表征納米材料誘發(fā)的神經(jīng)毒性反應。在設計這些研究時也應充分考慮其他試驗的信息，以盡量減少全身毒性繼發(fā)的效應。在完成風險評估時，還可以進行機制研究，以提高從動物到人體的外推把握度。

5. 內(nèi)分泌介導效應

納米材料可能對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，特別是對生殖系統(tǒng)，可能改變激素水平，還可能具有性別差異。改良的亞慢性毒性試驗可用于研究內(nèi)分泌干擾效應，應關注內(nèi)分泌相關毒性終點（如甲狀腺激素的測定、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關的大體解剖檢查和組織病理學檢查、動情周期檢查等）。