附件：登革病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年第32號）.doc

登革病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對登革病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對登革病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

登革熱是由登革病毒（dengue virus，DV）引起的一種急性傳染病，廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，通常由蚊媒傳播。登革病毒感染可表現(xiàn)為無癥狀隱性感染、非重癥感染及重癥感染等。典型的登革熱病程分為三期，即急性發(fā)熱期、極期和恢復(fù)期。

登革病毒屬黃病毒科黃病毒屬，為RNA病毒，基因組由單股正鏈RNA組成，共有4個血清型（DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4），4種血清型均可引起登革熱的感染和流行，各型病毒間抗原性有交叉。與寨卡病毒、乙腦病毒、西尼羅病毒等其他黃病毒抗原性有交叉。

登革病毒感染的常用的實驗室檢測包括血常規(guī)、血生化檢查、病原學(xué)和血清學(xué)檢查等。核酸檢測是登革熱病原學(xué)檢測的重要參考。我國《登革熱診療指南（2014年第2版）》中，明確：患者急性發(fā)熱期可應(yīng)用登革病毒核酸檢測進(jìn)行早期診斷。疑似或臨床診斷病例，急性期血清檢測出病毒核酸，可作為確診依據(jù)。我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《登革熱診斷》（WS 216—2018），也將登革病毒RNA檢測列入登革熱病原學(xué)檢測方法，用于登革熱的早期診斷。

登革病毒核酸檢測試劑是指：利用分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等，以登革病毒共有的核酸序列為檢測靶標(biāo)，對血液樣本中的登革病毒進(jìn)行體外定性檢測的試劑，用于登革熱的輔助診斷。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于以登革病毒共有的靶核酸序列作為靶標(biāo)進(jìn)行檢測的試劑，對于預(yù)期用途為登革病毒分型核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗原理、最低檢測限及被測靶核酸序列的特性等方面寫明申報試劑與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若被測物為新的靶核酸序列，則應(yīng)詳細(xì)論述檢測靶標(biāo)與登革熱診斷的相關(guān)性，并提供充分的支持資料。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對照、陽性對照、內(nèi)對照以及企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

申請人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)制備過程，包括組成、來源、毒株特性（如名稱、型別、濃度）、溯源及定值資料等信息。企業(yè)參考品的項目應(yīng)包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、重復(fù)性參考品等。陽性參考品應(yīng)包含DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4型標(biāo)準(zhǔn)毒株或臨床分離株；陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況；精密度參考品應(yīng)至少包含兩個濃度水平，其中包含弱陽性水平。建議采用滅活的毒株建立企業(yè)參考品，不宜僅采用質(zhì)粒、假病毒、基因組提取/純化物等核酸。

申報試劑的質(zhì)控體系應(yīng)包含陽性、陰性、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）等。對樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果，進(jìn)行質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種對照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。申報資料應(yīng)詳細(xì)描述對照的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。

1.內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對照可對實驗過程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的目的序列設(shè)計、構(gòu)建進(jìn)行詳細(xì)的闡述，并對引物、探針和模板濃度做精確的驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

2.陽性對照

陽性對照可對實驗完整過程進(jìn)行質(zhì)控。陽性對照可為：含有靶核酸序列的病毒樣顆粒或滅活的登革病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株或臨床分離株，濃度水平為高于最低檢測限水平的弱陽性或中等陽性。企業(yè)應(yīng)對各種陽性對照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。

3.陰性對照

陰性對照對可能存在的由非特異性引起的假陽性進(jìn)行質(zhì)控。陰性對照不含待測靶序列，基質(zhì)應(yīng)盡量與待測樣本相同或相近。需參與樣本核酸的平行提取/純化。

4.空白對照（如適用）

由不含模板的緩沖液或樣本保存液組成，用于對擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)的外界靶核酸污染和其他升高的背景進(jìn)行質(zhì)控?？瞻讓φ招鑵⑴c樣本核酸的平行提取/純化。對于一些經(jīng)特殊設(shè)計的檢測試劑，可不常規(guī)設(shè)置空白對照。如：采用單管獨立反應(yīng)體系進(jìn)行檢測的試劑。此時應(yīng)詳述不進(jìn)行設(shè)置的考慮。

5.核酸提取/純化組分（如適用）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

6.PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

6.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細(xì)資料。

6.2引物和探針

需提供靶序列選擇的研究資料；引物、探針的設(shè)計資料，包括設(shè)計原則、序列信息，設(shè)計合理性分析等，需提供對序列準(zhǔn)確性、純度、濃度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的詳細(xì)資料。如為外購，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。

6.3 PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；應(yīng)提供有關(guān)外觀、保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的詳細(xì)資料。

逆轉(zhuǎn)錄酶，應(yīng)具有聚合酶活性，在適宜溫度條件下可進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)提供有關(guān)外觀、保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

7. RNase抑制劑（如適用）

可抑制RNA酶可能造成的污染。應(yīng)提供外觀、活性及功能性試驗的驗證資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料
　　主要生產(chǎn)工藝包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。
　　生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.對生產(chǎn)工藝主要控制點進(jìn)行闡述。

3.核酸提取/純化方法確定的研究資料。

4.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量及反應(yīng)體積等。
　　5.確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。
　　6.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

（四）分析性能評估資料
　　企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對申報試劑進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，包括具體的試驗方法（操作步驟）、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。對于登革病毒核酸檢測試劑，建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.檢出能力

1.1最低檢測限的確定

建議使用DENV-1～DENV-4型培養(yǎng)后的登革病毒原液的梯度稀釋液來確定最低檢測限。應(yīng)采用與待測樣本類型一致的樣本進(jìn)行稀釋。每個濃度梯度重復(fù)3~5份，每份進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，將具有95%陽性檢出率的濃度作為最低檢測限。應(yīng)明確毒株的來源、濃度、濃度的確定方法和制備稀釋方法等信息。企業(yè)可采用半數(shù)組織感染量測定法（TCID50）的方法進(jìn)行毒株濃度的確認(rèn)，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）的方法進(jìn)行毒株濃度的確認(rèn)，以PFU /mL作為毒株濃度的表示方式進(jìn)行毒株濃度的確認(rèn)。

1.2最低檢測限的驗證

在最低檢測限或接近最低檢測限濃度對DENV-1～DENV-4型登革病毒進(jìn)行驗證。每個血清型應(yīng)至少選擇多個流行毒株進(jìn)行驗證。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗證的各個毒株的來源、制備方法及濃度等信息。

1.3 申請人應(yīng)明確申報產(chǎn)品最低可檢出的登革病毒拷貝數(shù)水平，并提供確定過程及相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)，本研究應(yīng)針對四種不同的血清型分別進(jìn)行確認(rèn)。

2.分析特異性

2.1交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的和常見感染的其他病原體。具體目錄參見表1。

建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。建議進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證的細(xì)菌的最低濃度為106 CFU/mL（CFU：菌落形成單位）；進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證的病毒，如可進(jìn)行體外培養(yǎng)，其最低濃度為1×105 TCID50/mL。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗證的病原體的制備方法、來源、種屬和濃度等信息。

對于某些難以培養(yǎng)或者因為生物安全性無法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗證的病原體核酸的來源、組成和濃度等信息。采用病原體核酸樣本進(jìn)行試驗時，應(yīng)將核酸樣本視為實際使用過程中參與PCR反應(yīng)的核酸樣本，根據(jù)試劑說明書的要求配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。

有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中體現(xiàn)。

2.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（如脂血、溶血、黃疸等）、抗凝劑干擾和外源性藥物。

建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下，采用包含弱陽性樣本在內(nèi)的至少兩個登革病毒濃度水平的樣本進(jìn)行干擾研究。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗證。

3.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考國內(nèi)或國外的相關(guān)文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對申報試劑的精密度評價主要包括以下要求。

3.1對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除申報試劑（包括提取/純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對不同的適用機(jī)型（如PCR分析儀）、操作者、地點等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

3.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少12天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/運行間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進(jìn)行重復(fù)實驗以對室間精密度進(jìn)行評價。對于校準(zhǔn)周期較短的試劑，如短于2個月，精密度研究時間跨度應(yīng)至少包含兩個校準(zhǔn)周期。

3.3建議采用臨床樣本或采用含有靶核酸序列的病毒樣顆粒/登革病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株（“3.3.1陰性樣本”不適用）添加至與適用樣本類型一致的基質(zhì)中作為樣本，對至少包含陰性和弱陽性濃度的四個濃度水平進(jìn)行驗證：

3.3.1陰性樣本：不含待測靶物質(zhì)的樣本，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

3.3.2 高陰性/弱陽性樣本（C20~C80）：濃度略低于試劑盒的陽性判斷值，重復(fù)檢測陰性率為20%~80%。（n≥20）。

3.3.3弱陽性樣本：濃度略高于試劑盒的陽性判斷值，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

3.3.4中等陽性樣本：濃度高于試劑盒的陽性判斷值，陽性檢出率應(yīng)100%（n≥20）。

4.核酸分離/純化性能

在進(jìn)行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。血清/血漿樣本經(jīng)不同的核酸分離/純化過程所獲得登革病毒核酸的純度和核酸量會有不同。因此，無論檢測試劑是否包含有核酸分離/純化的組分，申請人都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的性能，對配合使用的核酸分離/純化試劑（方法）的提取效率、提取濃度和抗干擾進(jìn)行充分的驗證。

對于說明書中聲稱可配合兩個或以上提取試劑或提取方法的檢測試劑。申請人應(yīng)對選定的每一種提取試劑/方法進(jìn)行驗證，一般而言，至少包含最低檢測限和精密度的驗證。

（五）陽性判斷值確定資料

對于基于熒光探針PCR方法的檢測試劑，陽性判斷值確定資料主要是指Ct值的確定資料。申請人應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法建立檢測試劑的陽性判斷值。申請人可采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)確定的詳細(xì)的研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制（如適用）等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法、接受標(biāo)準(zhǔn)、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批試劑在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏、冷凍（如適用）和運送條件下的有效期驗證。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。

對于樣本提取后不能立即進(jìn)行檢測的，應(yīng)明確核酸儲存條件、儲存時間等，同時應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料，核酸樣本如可以冷凍，亦應(yīng)提交凍融次數(shù)研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床評價

1.研究方法

1.1如有同類產(chǎn)品上市，申請人可選擇已上市產(chǎn)品作為參比試劑針對臨床樣本進(jìn)行比較研究試驗，證明試驗用體外診斷試劑與已上市產(chǎn)品等效。選擇參比試劑時，應(yīng)充分考慮其分析性能，如最低檢測限等，確?？己嗽噭┡c參比試劑具有可比性。

1.2申請人亦可采用核酸序列測定方法作為參比方法，驗證考核試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定（測序）結(jié)果之間的一致性情況。臨床研究中應(yīng)對選用的測序方法做詳細(xì)介紹，并對委托測序服務(wù)的機(jī)構(gòu)（如涉及）資質(zhì)和選擇依據(jù)作簡要說明或提供相關(guān)資料。

1.3除上述1.1/1.2比對試驗外, 申請人同時應(yīng)進(jìn)行部分與病毒分離培養(yǎng)鑒定進(jìn)行比對的臨床試驗。

1.4其他：關(guān)于1.2的測序試驗，申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細(xì)試驗資料，需有臨床試驗單位的簽章確認(rèn)。

1.4.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

1.4.2測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設(shè)計應(yīng)合理涵蓋考核試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段。

1.4.3對所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與申報試劑的相關(guān)性能進(jìn)行比對分析。

1.4.4測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

1.4.6提交臨床病例的確診信息，并提交測序結(jié)果和臨床確診信息的統(tǒng)計分析資料。

2. 臨床試驗機(jī)構(gòu)的選擇

登革熱屬于區(qū)域性傳染性疾病，建議申請人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域選擇臨床試驗機(jī)構(gòu)，應(yīng)是經(jīng)備案的醫(yī)療器械臨床試驗機(jī)構(gòu)。臨床試驗機(jī)構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床試驗機(jī)構(gòu)的方案設(shè)計應(yīng)一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/剔除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被剔除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性，對于編盲的方式應(yīng)有詳細(xì)描述。各研究單位選用的參比試劑及試驗儀器應(yīng)一致，以便進(jìn)行匯總統(tǒng)計分析，且嚴(yán)格遵循考核試劑/參比試劑的說明書要求進(jìn)行操作。臨床方案中還應(yīng)明確當(dāng)二者檢測結(jié)果不一致時，第三方確認(rèn)試劑/第三方確認(rèn)方法。另外，考核試劑適用的樣本類型等不應(yīng)超越參比試劑的相應(yīng)檢測要求，若此種情況發(fā)生，則應(yīng)選擇其他合理參比方法對額外情形進(jìn)行驗證。

由于需采用登革血清學(xué)分型試劑，對于需要分型的病例，各臨床試驗機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)采用統(tǒng)一的分型確認(rèn)方法。

病毒分離培養(yǎng)鑒別的方法可參考原衛(wèi)生部發(fā)布的《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》中附錄A.3“C 6/36白紋伊蚊細(xì)胞分離登革病毒”或附錄A.4“應(yīng)用乳小白鼠分離登革病毒”方法進(jìn)行病毒分離鑒定檢測,各臨床試驗機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)采用統(tǒng)一的登革病毒分離培養(yǎng)鑒定方法。

4.病例選擇及陽性病例比例

適當(dāng)?shù)臉颖玖渴潜ＷC體外診斷試劑臨床性能得到準(zhǔn)確評價的必要條件。臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行估算。根據(jù)不同的預(yù)期用途，設(shè)計相應(yīng)臨床試驗，以輔助診斷用途為例，臨床試驗可依據(jù)試驗用體外診斷試劑相對于對比試劑的陰陽性符合率分別估算最低陰陽性樣本例數(shù)。

臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計算，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗用體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%。獲得臨床試驗數(shù)據(jù)后，證明產(chǎn)品相對于對比方法的陰陽性符合率（置信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

臨床試驗應(yīng)以發(fā)熱疑似登革熱患者作為研究對象，應(yīng)以前瞻性收集樣本為主，至少包含前瞻性新鮮樣本的DEN-1型、DEN-2型，對于DEN-3型、DEN-4型陽性病例，如較難獲得，可采用回顧性收集病例。每種型別陰、陽性例數(shù)以及陰、陽性符合率置信區(qū)間上下限應(yīng)當(dāng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求。

病毒分離培養(yǎng)應(yīng)入組一定數(shù)量的陽性及陰性病例，考察考核試劑與病毒分離培養(yǎng)結(jié)果的一致性，納入的例數(shù)及與病毒分離培養(yǎng)對比的結(jié)果也應(yīng)當(dāng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求。

申請人還應(yīng)納入一定數(shù)量其他發(fā)熱病例、黃病毒（如有）感染病例做為干擾病例進(jìn)行臨床試驗。應(yīng)當(dāng)在臨床試驗方案中進(jìn)行設(shè)計，并臨床報告中進(jìn)行統(tǒng)計。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果有無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

干擾病例應(yīng)當(dāng)在臨床試驗方案中進(jìn)行設(shè)計，并在臨床報告中進(jìn)行統(tǒng)計。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

7.1臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

7.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

7.1.4統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

7.2具體的臨床試驗情況

7.2.1臨床研究所用產(chǎn)品的名稱、批號、有效期及所用機(jī)型等信息，以及對比試驗產(chǎn)品的注冊情況。

7.2.2對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進(jìn)行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

7.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

7.3統(tǒng)計學(xué)分析

7.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

7.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率。

7.3.3以交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

7.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。

登革病毒核酸檢測試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒適用范圍內(nèi)不同血清型登革病毒的檢測能力，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進(jìn)行驗證。

如果申報試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對登革病毒核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地編制說明書。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測人血清和/或血漿樣本中的登革病毒RNA。

1.2簡單介紹登革病毒核酸的類型與結(jié)構(gòu)、病毒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分類；登革病毒的傳播方式及媒介；包括哪些血清型；致病性與免疫性；感染后的臨床表現(xiàn)；流行病學(xué)及實驗室常用的檢測手段。

1.3待測人群特征介紹：根據(jù)《登革熱診療指南》確定的疑似登革病毒感染的人群。

1.4 注意：登革疫情監(jiān)控的用途，不屬于體外診斷試劑批準(zhǔn)范圍，不得在預(yù)期用途中聲稱。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取/純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過驗證后推薦配合使用的商品化核酸提取/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號、醫(yī)療器械注冊證號等詳細(xì)信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒檢測的靶核酸序列進(jìn)行詳細(xì)描述（名稱和基因位置等），對照設(shè)置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行逐項介紹。

3.2核酸提取/純化方法、原理等。

3.3簡要介紹試劑盒技術(shù)原理及質(zhì)控的作用機(jī)理。

4.【儲存條件及有效期】 

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲存條件及有效期。如需列明運輸穩(wěn)定性，應(yīng)明確運輸條件與時限。

5.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容：

5.1樣本的收集：明確推薦的樣本采集時間（如發(fā)病后立即進(jìn)行采樣）。樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

5.2樣本的運送和保存：明確保存條件及期限（短期、長期）、運送條件等。如聲稱樣本可以凍存，還應(yīng)明確凍融次數(shù)的限制。

6.【適用儀器】所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗方法】詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法、注意事項。

7.3詳述待測樣本及相關(guān)對照核酸提取/純化的條件、步驟及注意事項。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動化檢測程序及相關(guān)注意事項。

7.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況、對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

7.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法或相應(yīng)的自動化檢測程序。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）、核酸提取/純化對照（如適用）以及樣本管檢測結(jié)果的Ct值，以列表的形式對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合（如陽性、陰性、無效）及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。明確無效結(jié)果的處理方式，如重新進(jìn)行檢測等。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)明確灰區(qū)的Ct值定義，并詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1本試劑僅適用于對具有相關(guān)臨床癥狀的患者進(jìn)行檢測。

9.2本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

9.3對于免疫抑制患者，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋檢驗結(jié)果。

9.4陰性結(jié)果不能排除登革病毒感染，對于發(fā)熱癥狀出現(xiàn)后3~6天內(nèi)采集的樣本，應(yīng)額外進(jìn)行登革病毒IgM抗體檢測，以提高檢出。

9.5陽性結(jié)果并不表明存在感染性病毒或確定疾病癥狀是由登革病毒感染引起的。

9.6不恰當(dāng)?shù)臉颖静杉⑦\送及處理，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；低于最低檢測限水平的病原體核酸濃度，也可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.7未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.8本試劑盒未進(jìn)行基于新生兒樣本的性能驗證。

9.9登革病毒感染患者病情監(jiān)測的用途未經(jīng)驗證。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)（包含但不限于）：

10.1 最低檢測限：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢測限的試驗方法及結(jié)果。

10.2精密度：精密度參考品的組成、濃度及結(jié)果。

10.3分析特異性

10.3.1交叉反應(yīng)：對出現(xiàn)在相應(yīng)臨床標(biāo)本中可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗證情況，建議以列表的方式明確經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、菌株特性、濃度等信息；

10.3.2干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，包括內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)；

10.4對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

10.5境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗數(shù)據(jù)總結(jié)。

11【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1有關(guān)人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)xx組份可能含有人源物質(zhì)，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

11.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號，或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

11.3實驗操作人員應(yīng)接受過基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實驗操作資格，實驗室應(yīng)符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》及其他涉及到傳染性病原微生物的管理規(guī)定中的相關(guān)要求。

三、參考文獻(xiàn)

1.《登革熱診療指南（2014年第2版）》，中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，2014.10.11。

2.《登革熱診斷》，中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS 216-2018）。

3. Class II Special Controls Guideline: Dengue Virus Nucleic Acid Amplification Test Reagents, Guideline for Industry and Food and Drug Administration Staff, September 2014, FDA.

四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。